1、范圍
本標準規(guī)定了農(nóng)業(yè)生物質(zhì)原料中纖維素和半纖維素含量測定的高效液相色譜方法，以及木質(zhì)素含量測定的紫外分光光度方法和重量方法。
本標準適用于農(nóng)作物秸稈纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的測定。
2、規(guī)范性引用文件
GB/T 6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法
NY/T 3492?農(nóng)業(yè)生物質(zhì)原料?樣品制備
3、試劑和材料
除非另有說明，所有試劑均為分析純的試劑，色譜用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水，其他使用三級水。
3.1乙醇:95%.
3.2 72%硫酸溶液:量取665 mL硫酸(98%)，緩緩注入300 ml水中，冷卻，搖勻。
3.3 碳酸鈣。
3.4 D-纖維二糖、D(+)葡萄糖、D (+)木糖、D(+)半乳糖、L(+)阿拉伯糖、D(+)甘露糖標準品:純度≥95%。
4、儀器和設備
4.1 分析天平:感量0.1 mg。
4.2 索氏抽提器:250 mL。
4.3 電熱鼓風干燥箱:溫度可控制在(45±3)℃和(105±3)℃。
4.4 恒溫水浴鍋：溫度可控制在(30±3)℃?。
4.5 高壓蒸汽滅菌器：溫度可控制在(121±3)℃?。
4.6 馬弗爐:可程序開溫，溫度可控制在(575±25)℃?。
4.7 耐壓試管:螺紋具塞，耐壓≥60psi。
4.8 真空過濾器:配玻璃砂芯坩堝(G4)。
4.9 高效液相色譜儀:配示差折光檢測器。
4.10 紫外-可見分光光度計:可在 320 nm處測定吸光值。
4.11 ?微孔過速器:帶0.22μm水相微孔濾膜。
5、分析步驟：
按照NY/T 3492的規(guī)定執(zhí)行。
5.2.1水抽提
稱取2g~10g試樣(精確至0.1 mg)于已稱重的濾紙筒中，將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內(nèi),連接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入190 mL水，于電熱套上加熱，使水不斷回流抽提(4次/h~5次/h)，一般抽提6h~8h。抽提完成后，關閉加熱套，將索氏抽提器冷卻至室溫。
5.2.2乙醇抽提
將5.2.1水抽提后的抽提筒連接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入190 mL乙醇，于電熱套上加熱，使乙醇不斷回流抽提(6次/h~10次/h），一般抽提16h~24h。抽提完成后，關閉加熱套，將索氏抽提器冷卻至室溫。經(jīng)兩步抽提后的生物質(zhì)試樣(即不含抽提物試樣)在(45±3)℃干燥箱中干燥至恒重，稱量試樣質(zhì)量精確至0.1 mg。
5.3.1坩堝恒重
將玻璃砂芯坩鍋(G4)置于馬弗爐中，在(575±25)℃下灼燒至恒重。將坩堝從馬弗爐中取出后放入干燥器冷卻，稱量坩堝質(zhì)量精確至0.1 mg。
5.3.2濃酸水解
稱取300.0mg(精確至0.1mg)不含抽提物試樣至耐壓試管，每個試樣做2次以上平行實驗。向耐壓試管中加入3.00 mL 72%硫酸溶液后立即混合均勻，將耐壓試管放入(30±3)℃水浴中，5 min~10min攪拌一次。恒溫60 min后取出，向耐壓試管中加入84.00 mL水，擰緊蓋子混合均勻。
5.3.3糖的回收率
用于計算回收率的糖標準溶液稱為糖回收標準溶液，包括D(+)葡萄糖、D (+)木糖、D (+)半乳糖、L(+)阿拉伯糖、D(+)甘露糖。糖回收標準溶液的糖濃度應該與檢測試樣的糖濃度接近。稱量每種糖的質(zhì)量精確至0.1 mg，放入耐壓試管中，加入10.0 mL水，再加入348μL72%硫酸溶液,擰緊蓋子混勻。用微孔過濾器過濾,分裝于樣品瓶中，冷凍儲藏，使用時取出解凍并搖勻。
5.3.4稀酸水解
將裝有試樣和糖回收標準溶液的耐壓試管放入高壓蒸汽滅菌器中，121℃水解1 h，待水解產(chǎn)物冷卻至室溫后，通過玻璃砂芯坩堝(G4)過濾，用錐形瓶收集濾液約50 mL，轉(zhuǎn)移至具塞容器0℃~4℃儲藏，于24h內(nèi)進行纖維素和半纖維素測定，6 h內(nèi)進行酸溶木質(zhì)素的測定。
5.4.1酸溶木質(zhì)素
使用5.3.4酸水解溶液，用紫外-可見分光光度計在320 nm處測量液體試樣的吸光值。用水作紫外-可見分光光度計空白,用水稀釋試樣至吸光值為0.7~1.0，記錄稀釋倍數(shù)，記錄吸光值精確到0.001。
5.4.2酸不溶木質(zhì)素
5.4.2.1用大于50 mL的熱水沖洗100 mL具塞耐壓試管中殘留的酸不溶殘渣，使殘渣全部保留在玻璃砂芯坩堝(G4)中，并用真空過濾器抽干。在(105±3)℃烘干玻璃砂芯坩堝(G4)和酸不溶殘渣至恒重，記錄玻璃砂芯坩堝(G4)和酸不溶殘渣質(zhì)量，精確到0.1mg。
5.4.2.2將玻璃砂芯坩堝(G4)及酸不溶殘渣置于馬弗爐中(575±25)℃灼燒至少3 h，直至所有有機物被灰化。升溫速率控制在10℃/min,以防止試樣燃燒以及強氣流引起的試樣機械損失?；一Y束后降溫至105℃，取出放入干燥器中冷印。稱量坩堝和灰分質(zhì)量精確到0.1 mg。
5.4.3碳水化合物
5.4.3.1色譜條件
色譜柱:聚苯乙烯二乙烯苯樹脂鉛型糖分析柱，配備相應除灰保護柱。
流動相：水。
流速:0.6mL/min。
柱溫：80℃~85℃。
進樣量：20μL。
檢測器：示差折光檢測器，檢測器溫度盡可能接近柱溫箱溫度。
5.4.3.2標準曲線的繪制
參照表1中建議的濃度范圍準備D-纖維二糖、D(+)葡萄糖、D(+)木糖、D (+)半乳糖、L(+)阿拉伯糖、D(+)甘露糖的混合標準溶液，使用四點校正法。分別吸取20μL標準溶液注入高效液相色譜儀,在5.4.3.1色譜條件下測定標準溶液的響應值(峰面積)，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。
5.4.3.3 試樣溶液測定
取20 mL 5.3.4酸水解液體到50 mL錐形瓶中，緩慢加入碳酸鈣將水解液中和至pH5~6。待試樣沉淀后輕輕倒出上清液。將上清液用微孔過濾后進行高效液相色譜分析。由標準曲線回歸方程計算試樣中的D(+)葡萄糖、D(+)木糖、D (+)半乳糖、(+)阿拉伯糖和D(+)甘露糖含量。
注:檢測試樣中纖維二糖的含量高于3 mg/mL說明水解作用不完全。在纖維二糖之前有峰存在，表明試樣中糖發(fā)生了過度水解。
6、結果計算
試樣中的酸溶木質(zhì)素含量ASL，以質(zhì)量百分數(shù)(%)表示，按式(1)計算。
試樣中的酸不溶木質(zhì)素含量AIL，以質(zhì)量百分數(shù)(%)表示，按式(2)計算。
試樣中的總木質(zhì)素含量Lig，以質(zhì)量百分數(shù)(%)表示，按式(3)計算。
6.4.1糖回收率
D-纖維二糖、D(+)葡萄糖、D (+)木糖、D(+)半乳糖、L(+)阿拉伯糖、D(+)甘露糖的回收率Ri，以質(zhì)量百分數(shù)(%)表示，按式(4)計算。
6.4.2纖維素和半纖維素含量計算
6.4.2.1試樣中的葡萄糖、木聚糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖、甘露聚糖的含量Zi，以質(zhì)量百分數(shù)(%)表示，按式(5)計算。
6.4.2.2試樣中纖維素含量Cel，以質(zhì)量百分數(shù)(%)，按式(6)計算。
6.4.2.3試樣中半纖維素含量Hem，以質(zhì)量百分數(shù)(%)表示，按式(7)計算。
注:考慮農(nóng)作物秸稈中組成半纖維素的阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖含量較低,秸稈中半纖維素含量也可以木聚糖含量表示，
測定結果用平行測定的算術平均值表示，結果保留2位有效數(shù)字。
7、精密度
在重復性條件下獲得的2次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
